„RNA-terapie 101“ aneb Základy RNA-terapie v otázkách a odpovědích

Souhrn

Kardiovaskulární onemocnění (KVO) zůstávají v rozvinutých zemích hlavní příčinou úmrtí. Pro další snížení mortality a morbitidy se jeví jako zásadní prevence a důsledná terapie ovlivnitelných rizikových faktorů aterosklerotického kardiovaskulárního onemocnění, mj. dyslipidemie. V roce 2013 byla poprvé představena první RNA-terapie dyslipidemií (mipomersen namířený proti apoB v USA), avšak od té doby vývoj nových léčiv v této skupině pokračuje a RNA-terapeutika již hrají (např. inklisiran mířící proti PCKS9) a nadále budou hrát stále významnější roli nejen v preventivní kardiologii. Cílem tohoto článku je poskytnout základní přehled a co nejjednodušeji popsat současný stav znalostí týkajících se RNA-terapeutik se zaměřením na ASO a siRNA v lipidologii lékařům z klinické praxe s omezenou zkušeností s molekulární biologií.

Klíčová slova:

PCSK9 – RNA-interference – ASO – RNA-terapie – siRNA

Proč má lipidolog vědět o RNA-terapii?

Kardiovaskulární onemocnění (KVO) nadále zůstávají hlavní příčinou úmrtí v rozvinutých zemích a specificky ischemická choroba srdeční (ICHS) dle posledních statistik světové zdravotnické organizace (WHO –⁠ World Health Organization) z roku 2019 zodpovídá za 16 % všech úmrtí celosvětově [1]. I přes všechny pokročilé farmakologické a nefarmakologické léčebné strategie akutních ischemických příhod, které byly vyvinuty v posledních dekádách, se pro další snížení mortality a morbitidy jako zásadní jeví prevence a důsledná terapie ovlivnitelných rizikových faktorů aterosklerotického kardiovaskulárního onemocnění (ASKVO) zahrnující ischemickou chorobu srdeční, cerebrovaskulární onemocnění a nemoc periferních tepen. Zatímco neovlivnitelné rizikové faktory, jako je věk, pohlaví či rasa nezměníme, ovlivnitelné faktory, jako je dyslipidemie, ovlivnit lze a v 21. století již velice účinně. V pozičním dokumentu Evropské aterosklerotické společnosti dávají autoři dohromady dostupné práce, které ukazují, že akumulace LDL-cholesterolu (LDL-C) a dalších částic obsahujících apolipoprotein B (apoB) v arteriální stěně vede ke vzniku a progresi ASKVO a je pro vznik ASKVO kauzální [2]. V mendeliánských randomizovaných studiích pak bylo prokázáno, že i minimální snížení hladin LDL-C vyvolané mutacemi v genech zapojených do metabolizmu chole­sterolu/lipoproteinových částic brání před vznikem a zpomaluje progresi ASKVO –⁠ tj. že i malá změna působící v dlouhém časovém úseku může být protektivní (odtud koncept „čím dříve a déle, tím lépe“ a koncept „celoživotní dávky cholesterolu“) [3]. Ve zmíněném pozičním dokumentu [2] autoři také shrnují výsledky velkého množství humánních studií a klinických hodnocení, v nichž bylo prokázáno, že postupy, které snižují hladiny LDL-C, brání progresi ASKVO, a že čím větší je redukce hladin LDL-C, tím větší je redukce nežádoucích příhod bez toho, aby se objevily závažné nežádoucí efekty –⁠ odtud koncept „čím níže, tím lépe“. Naším cílem je tedy snížit hladily LDL-C co nejdříve, co nejvíce a udržet je takto sníženy co nejdéle –⁠ a k tomu můžeme využít celou řadu přístupů, od těch nefarmakologických, přes „klasické“ léky (statiny, ezetimib), přes moderní „biologickou“ léčbu s užitím protilátek (alirokumab a evalokumab) až po nově dostupná RNA-terapeutika (v současnosti inklisiran).

RNA-terapie do pole léčby dyslipidemií vstoupila poprvé v roce 2013 (mipomersen v USA) a další rozvoj v této oblasti nezadržitelně pokračuje. V následujícím textu chci představit problematiku mechanizmu účinku RNA-terapeutik lékařům v klinické praxi. Pro lepší uchopení problematiky jsem zvolil systém otázek a odpovědí, kterým se pokusím provést čtenáře základy molekulární biologie nezbytnými k pochopení dopadů, které RNA-terapie má a bude dále mít v naší klinické praxi.

Co je to dogma molekulární biologie a jak souvisí s RNA-terapií?

Základní dogma molekulární biologie je následující: genetická informace je uložena v DNA, odkud je v procesu transkripce (přepisu) přepsána do RNA, která funguje jako templát, dle kterého je v procesu translace (překladu) přeložena do proteinu. Souhrn všech genů (DNA) v buňce označujeme jako genom, souhrn všech RNA jako transkriptom a souhrn všech proteinů jako proteom (některé jeho podsložky, např. veškeré metabolity, pak označujeme jako metabolom apod), schéma 1.

To, že toto dogma není tak přímočaré, nám ukázal další výzkum. RNA-viry (konkrétně retroviry, mezi něž patří např. virus HIV) ukázaly, že existuje i reverzní transkripce (tj. reverzní přepis z RNA do DNA) [4] a výsledky mnoha dalších let výzkumů ukázaly, že ne všechna RNA v našich buňkách dává vznik proteinům. Konkrétně mezinárodní projekt ENCODE ukázal, že 90 % genomu je v průběhu ontogeneze aktivně přepisováno do RNA, avšak jen 2–3 % veškeré této RNA tvoří RNA, která kóduje proteiny (tzv. messengerová RNA –⁠ mRNA) [5]. Zbývajících 97–98 % přepsané RNA-proteiny nekóduje: postupně tak vznikl pojem nekódující RNA. Do kategorie nekódujících RNA spadá celá plejáda molekul –⁠ dle délky rozlišujeme dlouhé nekódující RNA (long non-coding RNAs –⁠ lncRNA) a krátké nekódující RNA (small non-coding RNAs –⁠ sncRNA), a tyto dvě kategorie pak zahrnují celou řadu různých tříd: ribosomální RNA (rRNA), transferovou RNA (tRNA), mikroRNA, PIWI-interagující RNA (piRNA), malé nukleární (snRNA) nebo nukleolární RNA (sncRNA), cirkulární RNA (circRNA) a další, schéma 2.

Nekódující RNA pak mají v těle význam regulační, tj. vzájemně se ovlivňují, interagují a jejich vzájemné vztahy regulují genovou expresi. A když tyto principy fungují přirozeně, tak proč jejich alteraci nevyužít k léčbě nemocí?

Co to je RNA-terapie?

RNA-terapií míníme léčbu, při níž místo „klasických“ léků (např. malých molekul či monoklonálních protilátek) využíváme (případně nějak upravujeme) molekulu ribonukleové kyseliny (RNA). „Klasické“ léky jsou typicky namířeny proti určitému proteinu (ať již jde o enzym, přenašeč, receptor, či jinak funkční protein), RNA-terapie působí o jeden krok dříve –⁠ na úrovni RNA. Prakticky máme několik možností, co můžeme udělat (schéma 3):

• můžeme cílovou RNA zablokovat pomocí exogenně do­dané RNA, čímž dokážeme omezit vznik nechtěného cílového proteinu
• můžeme cílovou RNA dodat/suplementovat, čímž můžeme podpořit vznik chtěného cílového proteinu, resp. přimět buňku produkovat cílový protein
• můžeme RNA editovat, tj. upravit její strukturu, a tím dosáhnout chtěného efektu

V užším slova smyslu využívají RNA-terapeutika pouze první zmíněný princip –⁠ tj. dodáním syntetické molekuly RNA blokujeme cílovou, v těle se vyskytující RNA. Na ty se zaměříme v dalším textu a otázkách, protože aktuálně tvoří nejrozšířenější skupinu RNA-terapeutik v oblasti lipidologie.

Druhý zmíněný princip –⁠ dodání mRNA jako templátu, byl využit u mRNA vakcín (BNT162b2 mRNA od společnosti Pfizer a BioNTech [6], a mRNA-1273 od společnosti Moderna [7]), které svůj „boom“ zaznamenaly v době pandemie COVID-19. Přes uvedené mRNA jsme do těla dodali informaci o struktuře spike proteinu viru Sars-CoV-2 a podle dodané mRNA jsme spike protein dokázali v těle vytvořit a vytrénovat tak náš imunitní systém jej rozpoznávat. Podobný princip nyní využívají vyvíjené nádorové vakcíny, jejichž cílem je vyvolat expresi nádorového antigenu, který poté rozpozná imunitní systém a pomůže nádorové buňky eradikovat [8].

Poslední zmíněný princip, editace RNA, je aktuálně intenzivně zkoumán –⁠ pomocí systému CRISPR-Cas a vedoucí RNA (guide RNA –⁠ gRNA) je totiž možné identifikovat cílovou sekvenci RNA a tu upravit –⁠ vyměnit jednu bázi za jinou, určitý úsek RNA „vystřihnout“, nebo naopak jiný úsek „vložit“.

Jaká máme RNA-terapeutika v „užším“ slova smyslu? Jaké jsou mezi nimi rozdíly?

Existují dva základní typy RNA-terapeutik v „užším“ slova smyslu: anti-sense oligonukleotidy (ASO) a malé interferující RNA (small interfering RNAs –⁠ siRNA). Každá skupina léčiv má svá specifika a základní rozdíl mezi nimi tkví v jejich struktuře: ASO jsou jednovláknové RNA, zatímco siRNA jsou dvo­u­vláknové RNA [9].

ASO fungují na principu „sterické interference“, tj. prakticky přímé vazby ASO a cílové RNA na principu komplementarity bází, při níž se adenin váže s uracilem (A-U) a cytozin se váže s guanozinem (C-G). Podané ASO se po té naváže na cílovou mRNA nebo pre-mRNA, kterou buď zablokuje, nebo aktivuje RNázu H, která cílovou RNA rozštěpí –⁠ oba mechaniz­my vedou ke snížení hladiny cílového proteinu. Oproti siRNA se ASO díky dvé struktuře dostávají nejen do cytoplazmy, ale i do jádra buňky, jejich efekt je tak komplexnější (ale potenciálně hůř predikovatelný), schéma 4.

siRNA fungují na principu tzv. RNA-interference. Jedná se o mechanizmus, který využívají tělu vlastní sncRNA, zejména mikroRNA. Dvouvláknová siRNA se nemůže oproti jednovláknové RNA (jako u ASO) přímo navázat na cílovou RNA. Místo toho je siRNA po vpravení do buňky zavzata do tzv. RISC, neboli RNA-indukovaného tlumícího (silencing) komplexu. RISC je tvořen skupinou proteinů, které dvouvláknovou RNA „rozpletou“: jedno vlákno (označované jako doprovodné) je následně v cytoplazmě degradováno, druhé vlákno (označované jako vodící) následně nasměřuje celý komplex RISC k cílové RNA. Komplex RISC se na tuto RNA naváže a rozštěpí ji, případně ji zablokuje pro translaci. Efekt je stejný jako u ASO –⁠ dojde ke snížení hladiny cílového proteinu, schéma 5.

Jak poznám, že pracuji s ASO nebo siRNA?

Rozdíl je zahrnut v názvu: přípravky na bázi ASO mají příponu -mersen (např. mipomersen), přípravky na bázi siRNA mají příponu -siran (např. inklisiran) [10].

Jakým způsobem RNA-terapeutika poznají svůj cíl?

Rozpoznání cílové RNA je určeno pořadím bází ASO/siRNA. Známe-li strukturu mRNA proteinu, který chceme blokovat, je nutné připravit ASO/siRNA tak, aby pořadí jejich bází (A, U, C, G) bylo komplementární k této mRNA. Tím je zajištěno, že ASO/siRNA působí proti jedné konkrétní mRNA, schéma 6.1 a 6.2.

Mohou mít RNA-terapeutika i „off-target“ efekty, tj. mohou ovlivnit hladiny i jiných mRNA, než těch, kterých chceme?

Ano, a to hned z několika důvodů, schéma 6.3, 6.4 a 6.5.

První problém nastává, pokud dojde ke konformační změně, resp. změně v terciární struktuře molekuly RNA: jednovláknové RNA mohou tvořit „kličky“ (hairpins), což může vést k tomu, že se k sobě přiblíží dva jiné její úseky a ASO/siRNA se na tyto může navázat.

Jiným problémem může být, že i když vytvoříme ASO/siRNA plně komplementární k cílové mRNA (přesná shoda bází), tak ne všechny báze se musí ve vazbě uplatnit –⁠ někdy se uplatní jen báze na pozici 2–8 ve vodícím vlákně, a i když báze na pozici 9 a dále nejsou komplementární, dojde stejně k vazbě i na tuto „necílovou“ mRNA a její blokádu.

Posledním problémem je interindividuální variabilita –⁠ v lidském genomu se vyskytuje celá řada jednonukleotidových záměn (SNP –⁠ Single Nucleotide Polymorphisms), a i když při vytváření ASO/siRNA používáme nejmodernější výpočetní technologie a rozsáhlé databáze všech známých genomů s cílem najít „specifickou sekvenci jen pro určitý cíl“, tak někteří jedinci mohou mít ve svém genomu SNP, který vytvoří nové vazebné místo pro naše ASO/siRNA, nebo naopak místo, na které cílíme, jeho vlivem zanikne.

I výše v textu je opakovaně napsáno, že volná RNA je rozložena, tj. volná RNA je nestabilní –⁠ jak to, že nedojde k degradaci RNA-terapeutik?

Volná RNA je vysoce nestabilní –⁠ v těle se nachází celá řada RNáz (enzymů štěpících RNA), které jakoukoliv volnou RNA ihned degradují (např. doprovodné vlákno ze siRNA), případně je volná RNA rozpoznávána celou řadou toll-like receptorů našich imunitních buněk (jedná se o součást nespecifické imunity namířené proti RNA-virům) a zničena [11]. RNA-terapeutika tak prošla dlouhým vývojem, během kterého byla molekula RNA různě modifikována, aby byla odolná vůči tělu vlastním RNázám a aby co nejméně inter­agovala s našim imunitním systémem.

Molekulu RNA můžeme obecně rozložit na dvě složky: „cukernou páteř“ tvořenou molekulami ribózy, které jsou propojeny fosfodiesterovými vazbami, a dále na ní „napojené“ nukleotidy (A, U, C, G). „Ribózovou kostru“ bylo potřeba modifikovat přidáním 2`-O-metylu a/nebo 2`-fluoru –⁠ tato modifikace zajistila vyšší stabilitu a ochranu před štěpením některých RNáz, schéma 7. Molekuly ribózy jsou pak přirozeně propojeny fosfodiesterovými vazbami –⁠ náhrada jednoho kyslíku ve fosfodiesterové vazbě sírou (fosfotionátová vazba) pak rovněž zvyšuje stabilitu, a navíc i zvyšuje vazbu na plazmatické proteiny (a tak delší biologický poločas léčiva před jeho vyloučením z těla).

Kromě modifikací „kostry“ je samozřejmě i druhá možnost, a tou je modifikace nukleotidů –⁠ nejčastěji je využívána modifikace uridinu za pseudouridin, což zvyšuje stabilitu molekuly.

siRNA jsou dvouvláknové molekuly. Jak pozná RISC, které vlákno je to „chtěné“ a pomocí kterého najde svůj cíl?

siRNA jsou dvouvláknové a jen jedno vlákno cílí proti cílové mRNA, např. proti mRNA pro PCSK9 v případě inklisiranu. Každé vlákno má svůj 3`a 5`konec. Přirozeně je vodící vlákno od doprovodného rozpoznáno pomocí „termodynamické asymetrie“ na 5`konci –⁠ ta strana siRNA, která má „méně stabilní“ 5`konec, se stává vodícím vláknem [12].

Vývoj siRNA-terapeutik pak tento proces selekce vodícího a doprovodného vlákna ještě zdokonalil –⁠ do kostry vlákna, které je a priori designováno jako doprovodné, bývá vložena jedna deoxyribóza (tj. v kostře z ribóz se najednou objevuje jedna deoxyribóza, kterou normálně nacházíme jen v DNA) –⁠ díky této úpravě je doprovodné vlákno ještě s větší pravděpodobností degradováno, což zvyšuje tzv. loading vedoucího vlákna do tlumícího komplexu (RISC).

Jak se RNA-terapeutika dostanou do cílové tkáně a ne jinam?

RNA-terapeutika do těla vpravuje subkutánně. Chceme-li dosáhnout lokálního efektu v místě podání, stačí RNA-terapeutika „obalit“ lipidovými nanočásticemi –⁠ budou tak vstřebány okolními buňkami a v nich budou působit.

Chceme-li však RNA-terapeutika dopravit do vybraných tkání, musíme využít další modifikace: na molekulu ASO či siRNA napojit molekulu, která funguje „jako adresa na dopise“. V současnosti tuto adresu známe pro dodání léčiva do jater: na ASO či siRNA je napojena tzv. GalNAc kotva –⁠ jedná se o 3 molekuly N-acetylgalaktosaminu spojené do „vidličky“. GalNAc se s vysokou afinitou váže na receptor ASGPR (asialoglykoproteinový receptor), a právě v podobě „trivalentní kotvy“ se k tomuto receptoru váže o několik řádů účinněji [13].

ASGPR se vyskytuje téměř výhradně na povrchu hepatocytů. Po vazbě léčiva je celý komplex vstřebán v procesu endocytózy do jaterní buňky: v endosomu dojde k odštěpění GalNAc-kotvy od RNA-terapeutika, které se rovnou dostává do cytoplazmy (v případě ASO i do jádra), ve které pak působí, jak bylo popsáno výše [14].

Tím, že se ASGPR vyskytuje výhradně na povrchu hepatocytů, je zajištěn transfer léčiva přímo do jaterní tkáně a nikam jinam. Zároveň je toto i hlavní slabinou pro další rozvoj RNA-terapeutik –⁠ zjednodušeně lze říci, že zatím ostatní tkáně moc specificky selektovat neumíme (neznáme jejich „adresu“).

Jaká je farmakokinetika RNA-terapeutik? Jak se dostanou z podkoží do jater, jak dlouho jsou v oběhu a jak dlouho v játrech?

Nejčastěji se ASO a siRNA podávají subkutánně, je možné i intravenózní podání. Farmakokinetika se pak odvíjí zejména od vlastností „cukerné kostry“ a jejích modifikací. Absorpce z podkoží je pomalá –⁠ vrcholové plazmatické koncentrace dosáhnout cca za 2–8 hodin, přičemž transport z místa vpichu je dominantně lymfatickou cestou [15,16].

Po vstupu do krevního oběhu se RNA-terapeutika vážou na plazmatické bílkoviny, zejména na albumin. Jejich biologická dostupnost je omezená. Léčiva vázaná na GalNAc-kotvu jsou během několika hodin vychytána v játrech přes receptor ASPGR, plazmatický poločas je v rozmezí 5–30 hodin. Do buněk vstupují endocytózou.

V buňkách se pak kumulují v cytoplazmě, v případě ASO i v jádrech buněk. Díky chemickým modifikacím popsaným výše je jejich intracelulární poločas v řádů týdnů až měsíců, což umožňuje dlouhé dávkovací intervaly.

Jaké jsou nejčastější nežádoucí účinky RNA-terapeutik?

Nejčastěji se setkáváme s reakcí v místě vpichu (zarudnutí, otok, bolest, indurace –⁠ souvisí s imunogenicitou, která byť je snížena výše popsanými modifikacemi, tak není nulová a jedná se o imunitní reakci v místě vpichu [11]), vzácněji se systémovou zánětlivou reakcí (zvýšená únava, myalgie, febrilie, zimnice –⁠ zprostředkováno cytokiny v rámci imunitní odpovědi). Laboratorně nejčastěji vidíme elevaci jaterních testů (dáno působením léčiva přímo v játrech). Vzácně se může objevit trombocytopenie či jiné reakce (renální poškození, anafylaktický šok) [17].

Jaká RNA-terapeutika jsou nyní dostupná v preventivní kardiologii a lipidologii?

Aktuálně schválenou terapií v lipidologii je inklisiran, tj. siRNA mířená proti PCSK9, který je indikován u familiální hypercholesterolemie a v sekundární prevenci ASKVO za specifikovaných podmínek [18], a volanesorsen, tj. ASO namířený proti APOC3, který je indikován u těžké hypertriglyceridemie [19].

V minulosti byl v USA pro léčbu homozygotní familiální hypercholesterolemie schválen lék mipomersen, tj. ASO mířené proti mRNA pro apoB-100, ale v Evropě nebyl schválen pro nežádoucí účinky v místě vpichu, které se vyskytovaly až u 90 % pacientů [20].

Ve vývoji jsou nyní další léčiva mířící proti Lp(a) –⁠ pelacarsen (ASO proti LPA mRNA) [21], olpasiran [22] a lepodisiran [23] (siRNA proti LPA mRNA) a proti ANGPTL3 –⁠ solbinsiran (siRNA proti ANGPTL3 [24]) a proti APOC3 –⁠ plozasiran [25].

Jaké jsou výzvy pro RNA-terapeutika v budoucnu?

V současné chvíli většina RNA-terapeutik míří do jater, zejména díky konjugaci s GalNAc-kotvou –⁠ identifikace nových způsobů doručení do dalších tkání může zajistit rozšíření i do dalších oblastí medicíny. V lipidologii, zejména při snižování hladin LDL-cholesterolu, budou RNA-terapeutika podávána chronicky –⁠ jistě bude nutné detailně sledovat možné projevy chronické toxicity, zejm. hepatotoxicity a nefrotoxicity, případně rozvoj imunitní odpovědi (a tím ev. snížení efektu léčby).

Několik slov závěrem

RNA-terapeutika již hrají a i nadále budou hrát významnou roli nejen v preventivní kardiologii, ale i v dalších oblastech medicíny. Cílem tohoto článku nebylo poskytnout vyčerpávající přehled nejnovějších poznatků, nýbrž popsat stávající stav znalostí týkajících se RNA-terapeutik se zaměřením na ASO a siRNA v lipidologii co nejjednodušším jazykem, tak aby byl mechanizmus jejich účinku srozumitelný i pro klinické lékaře s omezenou zkušeností s molekulární biologií.